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          人(Human)D-乳酸(DLA)ELISA检测试剂盒操作注意事项

          日期:2021-12-06 23:27
          浏览次数:1051
          摘要:检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联**吸附试验(ELISA)。往预先包被D-乳酸(D-LA)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的D-乳酸(D-LA)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

          操作注意事项

          1.  试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

          2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。

          3.  浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,*终结果乘以5才是样本实际浓度。

          4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

          5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

          试剂盒组成

          名称

          96孔配置

          48孔配置

          备注

          微孔酶标板

          12孔×8条

          12孔×4条

          标准品

          0.3mL*6管

          0.3mL*6管

          样本稀释液

          6mL

          3mL

          检测抗体-HRP

          10mL

          5mL

          20×洗涤缓冲液

          25mL

          15mL

          按说明书进行稀释

          底物A

          6mL

          3mL

          底物B

          6mL

          3mL

          终止液

          6mL

          3mL

          封板膜

          2张

          2张

          说明书

          1份

          1份

          自封袋

          1个

          1个

          注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、3、6、12、24、48μmol/L

          试剂的准备

           20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

          洗板方法

          1.  手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。

          2.  自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

          操作步骤

          1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

          2.  设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

          3.  样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白孔不加。

          4.  除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

          5.  弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

          6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

          7.  每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

          结果判断

           绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。