**异化型硝酸盐还原酶活性比色法定量检测试剂盒-价格/说明书技术支持

HEPENGBIO**异化型硝酸盐还原酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

技术背景

生物体获得能量的基本途径是氧化还原反应，即通过电子供体和受体之间的电子传递释放而来。在无氧条件下，硝酸盐作为终端电子受体，在硝酸盐还原酶（nitrate reductase；NaR）的存在下，进行硝酸盐还原反应，成为大多数微生物获得能量的途径之一。氮元素（nitrogen；N2）是生物体的生命元素，帮助参与产生蛋白质、核酸等生物分子。所有氮循环（nitrogen cycle）中的还原反应过程都包含通过硝酸盐还原酶催化的硝酸盐转化为亚硝酸盐的反应。原核生物硝酸盐还原酶是一种单核含钼的氧化还原酶，其分为三种：以硝酸盐为终端电子受体的呼吸异化型（respiratory dissimilatory；EC1.7.99.4）、周质异化型（periplasmic dissimilatory；EC1.7.99.4）和参与硝酸盐同化的同化型（assimilatory；EC1.9.6.1）硝酸盐还原酶。同化型也存在于高等植物和藻类等，是由含Mo、黄素和正铁血红素的亚单位所构成，分子内具有小的电子递体。**的电子供体主要为NADPH，可由硝酸盐诱导，可被氨和有机氮抑制。异化型酶存在于许多兼性好氧性**，多为与膜结构结合，且不溶性。一般含铁及钼，以细胞色素为电子供体；而专性嫌气性**产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的酶是可溶性的，以铁氧还蛋白为电子供体。大肠杆菌硝酸盐还原酶由4个142Kd和4个58Kd多肽构成的复合结构，分子量为800Kd。基于底物硝酸盐（nitrate），在还原型甲基紫精（methyl viologen）（替代细胞色素）作为电子供体的参与下，通过异化型硝酸盐还原酶（dissimilatory nitrate reductase；D-NaR）的催化作用，而还原为亚硝酸盐，进而通过格里斯试剂（Griess Reagent）氨苯磺胺（sulfanilamide）和N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐（N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride；NED），在酸性条件下的重氮化（diazotization）反应，产生紫红或粉红色的偶氮化合物（Azo compound），通过其吸光峰值的变化（540nm波长），来定量分析异化型硝酸盐还原酶的活性。其反应方式为：

产品内容

HEPENGBIO裂解液（Reagent A） 毫升

HEPENGBIO活性液（Reagent B） 微升

HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升

HEPENGBIO反应液（Reagent D） 微升

HEPENGBIO还原液（Reagent E1） 管

HEPENGBIO稀释液（Reagent E2） 毫升

HEPENGBIO底物液（Reagent F）      毫升

HEPENGBIO显色液（Reagent G）      毫升

HEPENGBIO标准液（Reagent H） 微升

产品说明书      1份

保存方式

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保存HEPENGBIO活性液（Reagent B）、HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO还原液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO显色液（Reagent G）避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作

1.5毫升离心管：用于制备样品和标准品的容器

微型台式离心机：用于样品处理

恒温水槽：用于反应孵育

96孔板或比色皿：用于比色的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

实验开始前，设定好分光光度仪或酶标仪（温度为25℃）：波长540nm，并置零。然后进行下列操作。

一、样品准备

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选择一：培养细菌

1． 准备好500微升待测**（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升）

2． 转移到到1.5毫升离心管

3． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）

4． 小心抽去上清液

5． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混匀

6． 加入xx微升HEPENGBIO活性液（Reagent B）

7． 强力涡旋震荡15秒

8． 置于冰槽里15分钟

9． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

11． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）

12． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

选择二：细菌培养液

1． 移取1毫升细菌培养液到1.5毫升离心管

2． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

3． 小心移取1毫升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

4． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

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二、标准样品配制

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到2至5号管

3． 移取xx微升HEPENGBIO标准液（Reagent H）到1号管

4． 小心移取xx微升1号管的HEPENGBIO标准液（Reagent H）到2号管，混匀

5． 小心移取xx微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent H）到3号管，混匀

6． 小心移取xx微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent H）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、 标准曲线测定

1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升上述配制的HEPENGBIO标准液（Reagent H）

3． 枪头抽吸数次，混匀

4． 室温下孵育20分钟

5． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）

6． 枪头抽吸数次，混匀

7． 室温下，孵育5分钟

8． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent G）

9． 室温下，孵育5分钟，避免光照

10． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

11． 重复实验步骤1至10四次

12． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准亚硝酸盐浓度（微摩尔/升）

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四、 样品测定

测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO还原液（Reagent E1）和HEPENGBIO稀释液（Reagent E2）置于冰槽里融化，然后移出xx微升HEPENGBIO稀释液（Reagent E2）到xx管HEPENGBIO还原液（Reagent E1），混匀后，置于冰槽里备用；用毕即刻放进－70℃保存。再将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO反应液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后移出40微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升上述配制的HEPENGBIO还原液（Reagent E），轻柔枪头混匀后，置于冰槽里，标记为HEPENGBIO反应工作液，放在暗室里备用。然后进行下列操作。

1． 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入50微升上述准备的待测样品（注意：细菌裂解样品为50微克蛋白）

3． 加入xx微升含有HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO还原液（Reagent E）的HEPENGBIO反应工作液

4． 枪头抽吸数次，混匀

5． 室温下孵育20分钟（注意：**培养液上清样品可以延长孵育至60分钟）

6． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）

7． 枪头抽吸数次，混匀

8． 室温下孵育5分钟

9． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent G）

10． 室温下孵育5分钟，避免光照

11． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

12． 根据标准曲线获得样品对应亚硝酸盐浓度（微摩尔/升）

13． 样品活性计算：

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五、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品

2． 分别移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到所有孔里

3． 分别加入xx微升上述配制的HEPENGBIO标准液（Reagent H）或待测样品（注意：细菌裂解样品为50微克蛋白）到相应孔里

4． 加入xx微升含有HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO还原液（Reagent E）的HEPENGBIO反应工作液到待测样品孔里

5． 加入xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到标准样品孔

6． 轻轻摇动96孔板

7． 室温下孵育20分钟（注意：**培养液上清样品可以延长孵育至60分钟）

8． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）到所有孔里

9． 轻轻摇动96孔板

10． 室温下孵育5分钟

11． 加入xx微升HEPENGBIO显色液（Reagent G）到所有孔里

12． 轻轻摇动96孔板

13． 室温下孵育5分钟

14． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数

15． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准亚硝酸盐浓度（微摩尔/升）

16． 根据标准曲线获得样品对应亚硝酸盐浓度（微摩尔/升）

17． 样品活性计算：

注意事项

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1． 本产品为25次操作，包括标准样品

2． 操作时，须戴手套

3． 样品中避免含有各种还原性化学物质，包括巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（dithiothreitol；DTT）、维生素C（ascorbic acid）和叠氮化钠（azide）等

4． 系统操作过程中，背景测定只需1次

5． 如果用户没有540nm波长的滤波器，可以使用530至560nm之间的任一波长替代

6． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

7． 样本测定吸光读数升高，表明具有酶活性

8． 如果待测样品浓度过高或过低，可以增加或减少甚至稀释样品量

9． 建议待测样本总蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HEPENGBIO30030.1）

10． 异化型硝酸盐还原酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔硝酸盐所需的酶量作为一个活性单位

11． 本公司提供系列硝酸盐还原酶分析试剂产品

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